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浦和红钻队徽:透明質酸對去卵巢大鼠模型骨關節炎的作用研究

時間:2019-09-11 10:49作者:張興 廖瑛 周君 曾亞
本文導讀:這是一篇關于透明質酸對去卵巢大鼠模型骨關節炎的作用研究的文章,骨性關節炎 (osteoarthritis, OA) 是關節紊亂的最常見形式, 其特征是關節軟骨退化、軟骨下骨重建、關節邊緣反應性新骨形成, 從而引起關節疼痛和僵硬, 最終導致關節功能障礙而影響生活質量。

日本浦和红钻主场 www.tczvwo.com.cn   摘    要: 目的 觀察透明質酸鈉對去卵巢大鼠骨關節炎關節軟骨及軟骨下骨的影響。方法 將30只雌性SD大鼠隨機分成3組, 每組10只, 分別為:假手術組、去卵巢-雙側前交叉韌帶切斷術組 (ovariectomy-anterior cruciate ligament transection, OVX-ACLT組) 、去卵巢-雙側前交叉韌帶切斷術+透明質酸鈉治療組 (治療組) 。假手術組不做任何處理, OVX-ACLT組及治療組行去卵巢并橫斷雙側膝關節前交叉韌帶術處理。術后2周, 治療組予雙側膝關節注射透明質酸鈉50μg, OVX-ACLT組予雙膝關節腔注射等劑量生理鹽水, 都以每周1次, 共治療12周。治療12周后處死動物, 檢測血液Ⅰ型膠原C端肽 (C-terminal telopeptides of type I collagen, CTX-Ⅰ) 、抗酒石酸酸性磷酸酶5b (tartrate resistant acid phosphatase 5b, TRACP5b) 、骨堿性磷酸酶 (bone alkaline phosphatase, BALP) 水平, 對關節軟骨行Mankin評分及軟骨下骨行Micro-CT骨量分析。結果 OVX-ACLT組血液中CTX-I、TRACP5b、BALP水平較假手術組明顯增高 (P<0.01、P<0.05、P<0.05) , 而治療組較OVX-ACLT組其水平明顯減低 (P<0.05、P<0.05、P<0.05) 。②三組Mankin評分比較:OVX-ACLT組較假手術組明顯增高 (P<0.01) , 治療組較OVX-ACLT組明顯減低, 差異有統計學意義 (P<0.01) 。③OVX-ACLT組的骨體積分數、骨小梁數量較假手術組明顯減低 (P<0.01、P<0.01) , 而骨小梁分離度較假手術組明顯增高 (P<0.01) , 骨小梁厚度較假手術組比較無明顯變化 (P>0.05) ;治療組的骨體積分數、骨小梁數量較OVX-ACLT組明顯增高 (P<0.01、P<0.01) , 而骨小梁分離度較OVX-ACLT組明顯減低 (P<0.01) , 骨小梁厚度較OVX-ACLT組比較無明顯變化 (P>0.05) 。結論 透明質酸鈉可改善軟骨下骨的骨質疏松現象, 維持軟骨下骨強度, 為關節軟骨提供生物力學支撐, 減少軟骨的異常應力吸收, 延緩骨關節炎關節軟骨的退變。

  關鍵詞: 骨關節炎; 軟骨下骨; 透明質酸; 關節軟骨; 骨質疏松;

  Abstract: Objective To observe the effect of sodium hyaluronate on both articular cartilage and the subchondral bone of osteoarthritis models in ovariectomized rats. Methods Thirty female SD rats aged of 3 months were randomly divided into 3 groups, sham-operated group, ovariectomized rats with bilateral anterior cruciate ligament transection (OVX-ACLT group) , ovariectomized rats with bilateral anterior cruciate ligament transection + intra-articular injection of sodium hyaluronate (treatment group) , with 10 rats in each group. Rats in the sham-operation group received no treatment. Rats in OVX-ACLT group and treatment group were ovariectomized and their anterior cruciate ligament of knee joint were transected. Two weeks after OVX-ACLT, rats in the treatment group received intra-articular injection of sodium hyaluronate, 50μg once a week for 12 weeks. Rats in the OVX-ACLT group were injected with normal saline. The rats were sacrificed after 12 weeks of treatment. The serum levels of C-terminal telopeptides of type I collagen (CTX-I) , tartrate resistant acid phosphatase 5 b (TRACP5 b) , and bone alkaline phosphatase (BALP) were detected. Mankin scores of articular cartilage were also evaluated. bone mass of subchondral bone was analyzed with micro-CT. Results The serum contents of CTX-I, TRACP5 b, and BALP in OVX-ACLT group were significantly higher than those in sham operation group (P<0.01, P<0.05, and P<0.05) , while those in treatment group were significantly lower than in OVX-ACLT group (P<0.05, P<0.05, P<0.05) . ②Comparison of Mankin scores among the three groups: the scores in OVX-ACLT group were significantly higher than in sham operation group (P<0.01) , and the scores in treatment group were significantly lower than in OVX-ACLT group (P<0.01) . ③The bone volume fraction and trabecular bone numbers in OVX-ACLT group were significantly lower than those in sham-operated group (P<0.01, P<0.01) , but the degree of bone trabecular separation was significantly higher than that in sham-operated group (P<0.01) . The trabecular thickness was not statistically different between the two groups (P>0.05) . The bone volume fraction and trabecular bone number in treatment group were significantly higher than those in OVX-ACLT group (P<0.01, P<0.01) , but the degree of bone trabecular separation was significantly lower than that in OVX-ACLT group (P<0.01) . The trabecular thickness was not statistically difference between the two groups (P>0.05) . Conclusion Sodium hyaluronate releases osteoporosis and maintains the strength in the subchondral bone. It provides biomechanical support for the articular cartilage, and reduces the abnormal stress absorption of the cartilage, and delays the degeneration of the articular cartilage.

  Keyword: osteoarthritis; subchondral bone; hyaluronic acid; articular cartilage; osteoporosis;

  骨性關節炎 (osteoarthritis, OA) 是關節紊亂的最常見形式, 其特征是關節軟骨退化、軟骨下骨重建、關節邊緣反應性新骨形成, 從而引起關節疼痛和僵硬, 最終導致關節功能障礙而影響生活質量[1]。OA的發病率已成為世界范圍內日益嚴重的健康問題[2]。而關節腔注射透明質酸 (hyaluronic acid, HA) 因可減輕OA疼痛, 并能改善關節活動, ?;と砉鞘瞧渲瘟芆A最常見的機制[3]。因此探尋透明質酸對OA治療的相關作用機制研究, 將有利于進一步尋找抑制病情發生的作用靶點, 為OA預防與治療提供新思路。
 

透明質酸對去卵巢大鼠模型骨關節炎的作用研究
 

  骨質疏松癥是人類最常見的骨病[4], 以絕經后卵巢產生的雌激素降低致使骨質流失的女性最為多見。雖然對于OA與骨質疏松之間的關聯尚未明確, 但有不同的報道表明, 在嚴重的髖或膝OA患者中, 骨量減少和骨質疏松占的比例很大[5], 而在遠離膝關節的部位, 縱向骨密度喪失與膝OA軟骨的進行性丟失有關[6]?;褂醒芯勘礱? 在OA伴骨質疏松癥的早期發展過程中, 可以檢測到骨的變化, 這些變化發生在軟骨下骨和膝OA患者的脛骨內[7]。以往的研究主要集中在使用膝關節不穩定所致的實驗性OA動物模型[8]。然而, 這些模型可能不適用于原發性OA, 尤其是絕經后OA。已有研究證實, 動物去卵巢 (ovariectomy, OVX) 能夠復制OA合并骨質疏松的體內模型, 模擬絕經后OA的病理生理進程[9,10]。因此, 本實驗聯合膝關節不穩和OVX, 在大鼠體內建立表現OA和骨量丟失的模型, 以探究透明質酸對OVX大鼠OA模型關節軟骨及軟骨下骨的影響。

  1、 材料和方法

  1.1、 材料

  1.1.1、 實驗動物:

  3月齡雌性SD大鼠30只, 平均體重約為256.7 g, 購于湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司, 動物許可證號:SCXK (湘) 2016-0002。實驗動物飼養于南華大學動物實驗室, 使用許可證號:SYXK (湘) 2010-0006。12 h間隔照明, 自由活動, 環境溫度為 21~27 ℃, 濕度為55%~65%。嚴格依照中華人民共和國《實驗動物管理條例》執行。

  1.1.2 、試劑與儀器設備:

  試劑:透明質酸鈉 (玻璃酸鈉, 山東博士倫福瑞達制藥有限公司, 批準文號:國藥準字H10960136) ;CTX-I、TRACP5b、BALP的ELISA 試劑盒 (編號號:7E2B2C3、7E2B2C5、7E2B2C9, 廣州皓躍生物科技有限公司) ;奧林巴斯光學顯微鏡 (CX41, 奧林巴斯, 日本) ;MSE Micro-Centaur Centrifuge 微型臺式離心機 (LD5-10B, Sanyo, Japan) ;Micro-CT (型號:ZKKS-MCT-Sharp, 廣州中科愷盛醫療科技有限公司) 。

  1.2、 實驗方法

  1.2.1、 實驗分組與造模:

  將30只SD雌性大鼠采用隨機統計學分成 3 組, 每組10只, 分別為:假手術組、OVX-ACLT 組 (去卵巢-橫斷雙側膝關節前交叉韌帶骨關節炎組) 、治療組 (去卵巢-橫斷雙側膝關節前交叉韌帶骨關節炎+透明質酸鈉治療組) 。參照文獻[11]:OVX-ACLT 組及治療組均采用去卵巢+橫斷大鼠的雙膝關節前交叉韌帶方法 (OVX-ACLT術) 建立骨質疏松合并OA動物模型。術后每只動物予青霉素4萬U肌肉注射2周, 預防性抗感染治療。術后2周, 治療組:雙側膝透明質酸鈉50μg[12]關節腔注射, 每周 1 次, 共治療12 周;ACLT 組:雙膝等量生理鹽水, 關節腔注射, 每周 1次, 共治療12 周;假手術組:不做任何特殊處理。實驗期間所有的大鼠均是自由活動和攝食飲水。

  1.2.2、 標本采集及處理:

  每組實驗動物于治療12周后取血, 頸椎脫臼法處死, 留取標本。眼眶靜脈叢取血約3~5 mL, 血液予以離心機離心后, 取上層血清, 保存于約-80 ℃冰箱中。取左側脛骨近端, 鈍性分離軟組織, 生理鹽水反復沖洗后, 切片后行番紅固綠HE染色。取右側脛骨近端置于 40 g/L多聚甲醛中固定, 保存送檢。

  圖1 3組CTX-I、TRACP5b、BALP濃度比較
圖1 3組CTX-I、TRACP5b、BALP濃度比較

  Fig.1 Comparison of CTX-I, TRACP5b, and BALP concentrations among the three groups

  1.2.3、 血清CTX- Ⅰ、TRACP5b、BALP檢測:

  使用ELISA測定 CTX- Ⅰ、TRACP5b、BALP等指標 (應用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗) 。

  1.2.4、 組織形態學觀察及 Mankin評分:

  對左側脛骨近端軟骨組織切片后行番紅固綠染色。按照改良 Mankin評分標準[13], 分別從軟骨組織結構、細胞數量、AB-PAS染色情況、潮線改變等評估關節損傷程度。其中 0~1 分為正常, 2~5 分為輕度, 6~9 分為中度, 10~14 分為重度。

  1.2.5、 Micro-CT技術觀察軟骨下骨:

  將固定于40 g/L多聚甲醛大鼠右側脛骨近端軟骨下骨取出后置于Micro-CT設備中進行檢測。分別從骨體積分數 (bone volume fraction, BV/TV) 、骨小梁厚度 (trabecular thickness, Tb.Th) 、骨小梁數量 (trabecular number, Tb.N) 、骨小梁分離度 (trabecular separation, Tb.Sp) 等方面對軟骨下骨行定量分析。

  1.3、 統計學處理

  選用 SPSS 18.0 軟件統計分析。計量資料以x?±sx?±s表示, 組間差異采用單因素方差分析。以 P<0.05 為差異具有統計學意義。

  2 、結果

  2.1、 3組血清 CTX-Ⅰ、TRACP5b、BALP濃度比較

  術12 周與假手術組比較, OVX-ACLT組中CTX-I、TRACP5b、BALP水平顯然高于假手術組 (P<0.01、P<0.05、P<0.05) ;治療組中CTX-I、TRACP5b、BALP水平顯然低于OVX-ACLT組 (P<0.05、P<0.05、P<0.05) 。見圖1。

  2.2、 光鏡下3組軟骨形態學及軟骨Mankin評分比較

  假手術組:軟骨細胞與基質分布均勻, 潮線清晰連續, 軟骨表層光滑, 軟骨層面完整。OVX-ACLT組:軟骨細胞與基質分布紊亂, 潮線模糊不完整, 軟骨表層破壞, 軟骨組織缺失, 裂隙增寬。治療組:軟骨組織結構排列尚有一定序列, 可見潮線完整連續, 軟骨表層輕度粗糙, 關節軟骨輕微變窄。3組Mankin評分比較:OVX-ACLT組較假手術組明顯增高 (P<0.01) ;治療組較OVX-ACLT組明顯減低 (P<0.01) 。見圖2、表1。

  圖2 3組軟骨組織形態學比較 (番紅染色 ×10)
圖2 3組軟骨組織形態學比較 (番紅染色 ×10)

  Fig.2 Comparison of cartilage tissue morphology among the three groups (saffron-stained, 10×)

  a.Sham-operated group; b.ACLT group;c.Treatment group.

  表1 3組大鼠關節軟骨Mankin評分比較(x?±s)(x?±s)
表1 3組大鼠關節軟骨Mankin評分比較(x?±s)(x?±s)

  2.3、 3組脛骨近端軟骨下骨Micro-CT比較及骨量分析

  通過脛骨近端軟骨下骨Micro-CT比較及骨量分析可見:治療后12周, OVX-ACLT組的BV/TV、Tb.N值較假手術組明顯降低 (分別P<0.01、P<0.01) , 而Tb.Sp值較假手術組明顯增高 (P<0.01) , Tb.Th兩組對比差異無統計學意義 (P>0.05) 。治療組的BV/TV、Tb.N值較OVX-ACLT組明顯增高 (分別P<0.01、P<0.01) , 而Tb.Sp值較OVX-ACLT組明顯減低 (P <0.01) , Tb.Th兩組對比差異無統計學意義 (P>0.05) 。見圖3、圖4。

  圖3 軟骨下骨顯微CT圖像
圖3 軟骨下骨顯微CT圖像

  Fig.3 Image of subchondral bone under micro-CT

  a.假手術組 b.OVX-ACLT組 c.治療組。

  a. sham-operation group; b. OVX-ACLT group; c. treatment group.

  圖4 3組脛骨近端軟骨下骨定量分析
圖4 3組脛骨近端軟骨下骨定量分析

  Fig.4 Quantitative analysis of subchondral bone of the proximal tibia in the three groups

  3、 討論

  OA現在被認為是一種全局性的關節衰竭, 涉及關節的所有組織:軟骨、滑膜和軟骨下骨[14]。近年來, 許多研究集中在軟骨下骨在該病病理生理特征中的作用。軟骨下骨是幾種動態形態改變的場所, 涉及一個重建進程[15]。在OA中, 軟骨下骨表現為骨吸收和骨形成的加速期[16], 這些變化與成骨細胞代謝的改變有關, 從而導致可溶性介質的異常生成。這種由骨細胞產生的介質可以通過骨軟骨界面影響深層軟骨細胞[17]。臨床上, 癥狀性OA患者軟骨下骨層面MRI上顯示更多的骨質病變, 從而強化了軟骨下骨的中心作用假說。因此, 軟骨下骨細胞可作為治療OA和減少軟骨降解的靶點。為了評價軟骨下骨成骨細胞在OA過程中的作用, 我們將在大鼠體內建立表現OA和骨量丟失的模型 (即OVX-ACLT) , 為透明質酸治療OA機制提供新的科學證據。

  臨床和流行病學研究表明, 絕經后女性因雌激素水平的急劇下降, 致使OA的發病率和嚴重程度均增加[18]。在基礎實驗中已有證據表明, 動物前交叉韌帶橫斷結合去卵巢完全可以建立OA合并骨質疏松的體內模型, 并模擬絕經后OA發生、發展的病理過程[11,19]。而且Bellido等[20]研究發現, OVX-ACLT模型組的軟骨損傷程度明顯高于單純ACLT橫斷OA模型組。本實驗發現OVX-ACLT組軟骨Mankin評分較假手術組的顯然增高, 鏡下可見軟骨細胞與基質分布紊亂, 潮線模糊不完整, 軟骨表層破壞, 軟骨組織缺失, 裂隙增寬, 表明軟骨嚴重受損。而通過Micro-CT圖像顯示:OVX-ACLT組軟骨下骨較假手術組明顯骨小梁連接稀疏、結構錯亂、分布面積窄, 同時骨量分析可看出OVX-ACLT組BV/TV、Tb.N值較假手術組明顯減低, 而Tb.Sp顯然增高, 提示OVX-ACLT組骨組織密度減低, 說明存在骨質疏松現象。與此同時, OVX-ACLT組中血清TRACP5b、BALP值明顯高于假手術組, 而TRACP5b、BALP可作為骨質代謝變化的敏感指標[21,22], 其值往往與骨密度表現為負相關性, 表明OVX-ACLT組骨量丟失。本實驗通過大鼠前交叉韌帶橫斷與去卵巢成功建立OA合并骨質疏松的體內模型, 并模擬了絕經后相關OA的病理生理過程。

  骨質疏松主要以骨量的丟失、骨微結構破壞為主, 本實驗發現軟骨下骨已存在骨質疏松現象。而軟骨下骨作用于軟骨的主要功能是為軟骨吸收應力、緩沖震蕩防止軟骨損傷和撐持軟骨形狀使其受力勻稱, 從而影響軟骨細胞的代謝等[23]。當骨質疏松發生時, 致使軟骨下骨骨代謝重建失常, 削弱了對軟骨吸收應力的能力, 導致過量的應力傳導使軟骨損傷, 從而促進了OA的發病進程[24]。已有研究報道, 骨質疏松致使軟骨下骨骨量的丟失, 會加速軟骨的損傷, 對OA的發生及發展起到重要作用[15,25]。因此在OA發生及進展中軟骨下骨的異常改變發揮重要作用, 其可作為OA預防及治療的新靶點[26]。

  透明質酸為大分子鏈狀糖胺多糖, 廣泛分布于軟骨細胞和滑膜細胞中, 作為關節軟骨的潤滑劑, 屏障和緩沖劑, 可防止軟骨損傷或變性, 從而延緩OA的進程[27]。國內外大量的研究, 已基本明確HA對軟骨的?;ぜ靶薷醋饔肹3,28]。另有研究表明, HA能穿透OA軟骨外植體并與軟骨細胞結合[29]。Hiraoka等[30]發現熒光透明質酸在兔OA模型關節內注射后, 被發現穿透軟骨下骨。在OA關節中, 軟骨和軟骨下骨之間出現血管化和微裂紋, 允許物質直接在軟骨和軟骨下骨之間移動[31]。Mladenovic等[32]發現HA可能調控RANKL/RANK/OPG信號通路影響軟骨下骨的骨吸收和骨形成, 從而影響軟骨下骨骨重建, 維持軟骨下骨中破骨細胞和成骨細胞的代謝動態平衡, 使軟骨下骨保持正常的生物力學性能, 從而抑制關節軟骨退變。同時, HA還可以通過與CD44結合來抑制基質金屬蛋白酶-13 (matrix metalloproteases 13, MMP-13) 的表達來?;と砉竅鹿塹奈⒔峁? 從而抑制軟骨退變[30,32]。CTX-Ⅰ是膠原蛋白降解的衍生物, 它也是骨代謝指標重要指標之一, 可間接反映軟骨下骨的活性。本實驗發現, OVX-ACLT組CTX-I水平較假手術組顯然增高, 而治療組較OVX-ACLT組顯然降低, 與此同時, 治療組中TRACP5b、BALP值也較OVX-ACLT組減低, 說明通過關節腔注射HA后可防止軟骨下骨骨量過分的丟失, 維持軟骨下骨強度, 為關節軟骨提供生物力學支撐。而在Micro-CT圖像顯示:治療組脛骨近端軟骨下骨較OVX-ACLT組骨小梁連接緊密、結構規律、分布面積廣, 在骨量分析可看出治療組BV/TV、Tb.N值較OVX-ACLT組明顯增高, 而Tb.Sp顯然降低, 說明關節腔注射HA可以改善軟骨下骨的骨質疏松現象, 改變軟骨下骨顯微結構, 減少軟骨的應力負荷。此外, 通過關節腔注射HA改善軟骨下骨后, 治療組較OVX+ACLT組中軟骨Mankin評分顯然減低, 有效的抑制了軟骨退變。

  綜上, 利用SD大鼠前交叉韌帶橫斷與去卵巢可成功建立OA合并骨質疏松的體內模型, 并模擬絕經后相關OA的病理生理過程。本實驗通過關節腔注射HA治療OA可有效地改善骨小梁的結構, 增強軟骨下骨硬度和強度, 使軟骨下骨的順應性加強, 從而減少軟骨的應力吸收, 防止軟骨的損傷。雖然對于HA具體如何作用軟骨下骨達到治療OA的效果機制尚未明確, 但軟骨下骨在OA的發生、發展的病理變化中扮演著重要角色, 其可作藥物治療OA潛在靶點。

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